Биологическая активность соединения тиобарбитуровой кислоты в нейробластомах

Пели И. Ли , Бекки Слэгл-Уэбб , Арун К. Шарма и Джеймс Р. Коннор.
Anticancer Research March 2021, 41 (3) 1171-1181; DOI: https://doi.org/10.21873/anticanres.14874

 

Предпосылки / цель: Ранее мы сообщали об идентификации цитотоксического соединения-I хемотипа (CC-I) из химической библиотеки, проводящей скрининг на глиобластому. Материалы и методы. Биологическая активность CC-I на лекарственно-устойчивых нейробластомах [например, вариант гена HFE C282Y, стабильно трансфицированный клетками SH-SY5Y нейробластомы человека (C282Y HFE / SH-SY5Y), SK-N-AS], была охарактеризована с использованием клеток культуральные модели и модели опухолей мышей in vivo. Результаты: CC-I имел сильную цитотоксичность в отношении терапевтически устойчивых клеток нейробластомы и ограниченную цитотоксичность в отношении первичных дермальных фибробластов человека. Кроме того, CC-I продемонстрировал устойчивый противоопухолевый эффект на устойчивые к терапии клетки нейробластомы человека C282Y HFE / SH-SY5Y, но не на клетки SK-N-AS в модели подкожной опухоли. CC-I индуцировал фосфорилирование белка теплового шока 27 (HSP27), протеинкиназы B (Akt), и N-концевую киназу c-Jun (JNK) в клетках нейробластомы C282Y HFE / SH-SY5Y. Заключение: CC-I может быть эффективным терапевтическим вариантом для резистентных к терапии нейробластом, особенно если они экспрессируют вариант гена C282Y HFE. Его противоопухолевые эффекты, возможно, связаны с активацией HSP27-Akt-JNK.

 

Нейробластома — вторая по распространенности солидная опухоль, обнаруживаемая у детей ( 1 ). Он начинается в нервных клетках за пределами мозга, чаще всего в надпочечниках, расположенных над обеими почками. Почти 90% нейробластом диагностируются к 10 годам ( 2 ). В Соединенных Штатах нейробластома ежегодно встречается примерно у 800 детей (в возрасте до 14 лет), что составляет 6% всех онкологических заболеваний у детей ( 3 ). Международная система стадирования риска нейробластомы была разработана Международной группой риска нейробластомы для стандартизации классификации риска нейробластомы и для клинических испытаний ( 4). Факторы риска нейробластомы включают возраст на момент постановки диагноза, стадию заболевания, гистологию опухоли и статус амплификации протоонкогенного белка N-myc (MYCN) ( 5 ). Хотя 5-летняя выживаемость для нейробластомы низкого риска составляет 95%, 5-летняя выживаемость для нейробластомы высокого риска составляет всего 40-50% ( 3 ).

коло половины нейробластом на момент постановки диагноза являются метастазами, и запущенное заболевание по-прежнему сложно успешно лечить, несмотря на агрессивную комбинированную терапию. Лечение нейробластомы обычно включает различные подходы, такие как химиотерапия, лучевая терапия, хирургическое вмешательство, трансплантация стволовых клеток, биологические агенты и иммунотерапия ( 6 , 7 ). У большинства пациентов с нейробластомой высокого риска будет рецидив, несмотря на получение агрессивной мультимодальной терапии, в то время как еще от 10% до 20% будут невосприимчивы к индукционной терапии ( 8 , 9). Из-за неоднородности заболевания среди случаев высокого риска последующее лечение с помощью спасательной химиотерапии может быть очень сложной задачей. Поэтому срочно необходима разработка новых средств лечения нейробластомы, особенно резистентной к терапии нейробластомы.

Ранее мы сообщали об идентификации соединения CC-I, производного тиобарбитуровой кислоты, в результате скрининга соединений библиотеки малых молекул ChemBridge, в качестве эффективного агента против лекарственно-устойчивых глиобластом (GBM) ( 10 ). Мы показали, что CC-I оказывает дозозависимое цитотоксическое действие на клетки астроцитомы, устойчивые к темозоломиду, вызывает апоптотическую гибель клеток и остановку клеточного цикла в фазах S и G 2 / M, ингибирует рост опухоли без токсичности и ингибирует топоизомеразу IIα. Мы также продемонстрировали, что CC-I и его аналоги обладают цитотоксическим и противоопухолевым действием на меланому человека, рак груди, рак толстой кишки, рак поджелудочной железы и клетки рака легких ( 11 , 12). В клетках меланомы (CHL-1, UACC903) два наиболее эффективных соединения индуцировали расщепление PARP и дозозависимо ингибировали антиапоптотические Bcl-2, Bcl-xL и сурвивин ( 11 ).

В этом исследовании мы охарактеризовали цитотоксичность и начали оценивать основные механизмы действия, которые могли, по крайней мере частично, отвечать за противораковую активность CC-I в устойчивых к терапии клеточных линиях нейробластомы человека, таких как SK- Клетки N-AS и C282Y HFE / SH-SY5Y и модели опухолей подкожной нейробластомы.

 

Материалы и методы

Материалы . Реагенты для клеточных культур, включая среду DMEM / F12, L-глутамин и трипсин-ЭДТА, были приобретены у Life Technologies (Гранд-Айленд, Нью-Йорк, США). Базальную среду для фибробластов и набор для роста фибробластов без сыворотки заказывали в American Type Cell Culture (ATCC). Фетальная бычья сыворотка (FBS) была получена от Gemini Bio-Products (West Sacramento, CA, USA). Соединение CC-I синтезировали, как описано ранее ( 11 ). Конечное соединение очищали хроматографией на колонке с силикагелем и характеризовали ядерным магнитным резонансом (ЯМР) и масс-спектром. Уровень чистоты CC-I составлял ≥99%.

Культура клеток, пролиферация клеток, лечение и анализ цитотоксичности . Чтобы определить эффективность CC-I против терапевтически резистентных нейробластом человека, мы использовали три клеточные линии нейробластомы человека (SK-N-AS, CHLA-171 и вариант C282Y HFE, стабильно трансфицированные клетки SH-SY5Y (C282Y HFE / SH-SY5Y). )). Клеточная линия SH-SY5Y была получена из костного мозга 4-летней женщины, тогда как клеточная линия SK-N-AS была получена из метастатического участка 6-летней женщины. Клеточная линия CHLA-171 была получена из прогрессирующего заболевания у 101-месячного пациента с нейробластомой мужского пола. Три клеточные линии имели неамплифицированный MYCN; однако статус p53 был другим. В то время как клетки SH-SY5Y и CHLA-171 имели p53 дикого типа, клетки SK-N-AS экспрессировали изоформу p53β ( 13). Клетки CHLA-171 имели нефункциональный p53 ( 14 ). Устойчивые к лекарствам клетки нейробластомы человека SK-N-AS были приобретены в ATCC (CRL-2137) и сохранены в DMEM с добавлением 10% FBS и 1X пенициллин-стрептомицин (10000 Ед / мл). Приобретенная линия клеток нейробластомы человека CHLA-171 с лекарственной устойчивостью была получена от Детской онкологической группы и культивирована в IMDM с добавлением 10% FBS, 4 мМ L-глутамина, 1X ITS (5 мкг / мл инсулина, 5 мкг / мл трансферрина, 5 нг / мл селеновой кислоты). Клеточные линии нейробластомы человека SH-SY5Y, приобретенные в ATCC (CRL2266), стабильно трансфицированные диким типом (WT) или мутантом C282Y HFE, поддерживали в среде DMEM / F12 с добавлением 10% FBS, 1% антибиотиков (пенициллин-стрептомицин). 1x заменимая аминокислота и генетицин (200 мкг / мл) ( 15). Аутентификация клеточной линии была выполнена Genetica (Берлингтон, Северная Каролина, США) с помощью STR-профилирования ДНК. Нормальные первичные дермальные фибробласты взрослого человека (nHDF) (ATCC PCS-201-012) поддерживали в базальной среде фибробластов с добавкой для роста. Все клеточные линии культивировали в инкубаторе с CO 2 при 37 ° C.

Для анализа пролиферации клеток клетки WT или C282Y HFE / SH-SY5Y высевали с плотностью 10000 клеток на лунку в 24-луночные планшеты, а затем подсчитывали количество живых клеток, используя 0,2% окрашивание трипановым синим в разные дни (n = 3 ). Также те же самые клетки высевали с плотностью 4000 клеток на лунку в 96-луночные планшеты, а затем измеряли рост клеток с помощью анализа пролиферации клеток MTS в течение десяти дней.

Для анализов цитотоксичности культивированные в течение ночи клетки ( например , 8000 клеток / лунку для C282Y HFE / SH-SY5Y; 20000 клеток / лунку для WT HFE / SH-SY5Y) подвергали воздействию соединений или контроля носителя ДМСО в течение 48 часов, а затем цитотоксичность оценивали с помощью МТТ-анализа в конце периода культивирования клеток. В другом анализе цитотоксичности культивированные в течение ночи клетки ( например , 4000 клеток / лунку для SK-N-AS, CHLA-171, nHDF) подвергали воздействию соединений или ДМСО в течение 72 часов, а затем оценивали цитотоксичность с помощью анализа MTT при конец периода культивирования клеток. Для изучения молекулярных механизмов концентрация CC-I зависела от времени воздействия и LC 50.(Летальная концентрация 50%). Например, если время воздействия соединения было коротким (2-24 ч), концентрация соединения была высокой (в 5-20 раз выше, чем LC 50, определенная для 2-3-дневного лечения). CC-I растворяли в ДМСО для получения исходного раствора перед разбавлением для обработки. LC 50 CC-I определяли с использованием статистического программного обеспечения (GraphPad Prism, версия 7) в качестве общего индикатора токсичности химического вещества.

Анализ апоптоза и некроза . Анализы апоптоза и некроза выполняли с использованием набора для апоптоза Annexin V-FITC (V13242, Invitrogen Molecular Probes, Юджин, штат Орегон, США) или набора для обнаружения апоптоза / некроза (ab176749, Abcam, Кембридж, Массачусетс, США). Вкратце, клетки (2 × 10 6 на чашку для культивирования клеток) культивировали до 24 или 48 часов с CC-I (10 ~ 36 мкМ) или актиномицином D (40-80 нМ, для апоптоза) или перекисью водорода (500 мкМ). для некроза) в качестве положительного контроля ( 10 , 16 , 17). После сбора и промывки в холодном буфере HANK клетки в 100 мкл буфера для анализа инкубировали с 2 мкл зеленого индикатора апопксина (100 ×), 1 мкл 7-аминоактиномицина D (7-AAD) (200 ×) и 1 мкл. CytoCalcein Violet 450 в течение 30 мин при комнатной температуре в темноте. Окрашенные клетки анализировали с помощью проточной цитометрии: зеленый цвет указывает на апоптотические клетки, а красный цвет указывает на апоптотические / некротические клетки на поздней стадии.

Анализ клеточного цикла . Клетки C282Y HFE / SH-SY5Y культивировали в течение 1 или 2 дней с CC-I или без него (18, 36 мкМ) для анализа клеточного цикла. После промывания холодным буфером HANK клетки фиксировали в ледяном 70% этаноле в течение ночи при –20 ° C. Затем клетки инкубировали с йодидом пропидия (100 мкг / мл) и РНКазой A (20 мкг / мл) в течение 15 мин при 4 ° C (в защищенном от света) и анализировали клеточный цикл с помощью анализатора проточной цитометрии BD FACS Calibur (BD Биологические науки, Сан-Хосе, Калифорния, США).

Модель подкожной опухоли нейробластомы . Противоопухолевый эффект CC-I оценивали с использованием моделей ксенотрансплантата мыши с подкожной опухолью нейробластомы (C282Y HFE / SH-SY5Y, SK-N-AS). Вкратце, самки мышей с тяжелым комбинированным иммунодефицитом (SCID) в возрасте 6-8 недель (штамм № 236, всего n = 18) или бестимусные голые мыши (штамм № 490, всего n = 13) (Charles River Laboratories, Уилмингтон, Массачусетс, США) ) имплантировали на бок ~ 200 мкл (5 × 10 6 клеток на мышь) среды клеток нейробластомы ( 18 , 19 ). Когда подкожные опухоли достигают примерно 80-100 мм 3по размеру (2-3 недели после клеточной имплантации) мышей случайным образом делили на контрольную и экспериментальную группы, сохраняя одинаковый диапазон объема опухоли в каждой группе. Для групп, обработанных CC-I, исходное соединение растворяли в 100% ДМСО, а затем разбавляли этанолом для приготовления рабочего раствора (5% ДМСО и 12% этанол или ДМСО / ПЭГ400 / Солютол) в день инъекции. CC-I вводили внутрибрюшинно один раз в неделю в течение 3-7 недель с использованием 70% максимально переносимой дозы (МПД) ( 10 ). Контрольной группе, обработанной носителем, внутрибрюшинно вводили инъекции по той же схеме. Здоровье и выживаемость мышей контролировали ежедневно. Вес тела и размер опухоли мышей измеряли один раз в неделю. Объем опухоли (V) измеряли штангенциркулем Вернье. Он рассчитывался по формуле V = (a 2/ 2) × b, где a и b— малая и большая оси очагов опухоли соответственно. В модели подкожной опухоли мы прекращали эксперимент после последней инъекции или когда опухоли начали мешать нормальным функциям, таким как прием пищи, питье, движение или оценка состояния тела (неинвазивная и эффективная оценка физического благополучия животного). менее 2. Если опухоль была изъязвленной или некротической, ее лечили тройным антибиотиком ежедневно с использованием стерильной ватной палочки и полностью закрывали. Чтобы проверить токсичность соединений, мы умерщвляли мышей кетамином / ксилазином (100/10 мг / кг массы тела, внутрибрюшинно) и зажимали пальцы ног, чтобы убедиться, что животные полностью находятся под анестезией. Когда не было ответа, выполнялась пункция сердца для получения крови от животного. После того, мышей подвергали шейному вывиху, чтобы обеспечить гуманное уничтожение животных. Токсичность крови (токсичность для печени и почек) оценивали с использованием автоматического химического анализатора (Roche Cobase MIRA, Bellport, Нью-Йорк, США) и наборов, произведенных Thermo Electron (Луисвилл, Колорадо, США). В течениеВ исследовании in vivo мышей содержали в безвирусных барьерных помещениях при 12-часовом цикле свет-темнота с доступом к пище и воде ad libitum. Все условия жизни животных соответствовали стандартам, требуемым Ассоциацией по оценке и аккредитации Международной лаборатории по уходу за больными (AAALAC International). Все процедуры выполнялись в соответствии с протоколами, утвержденными Комитетом по уходу и использованию животных (IACUC # 47185, # 47464) Медицинского колледжа штата Пенсильвания.

Вестерн-блоттинг. Клетки нейробластомы человека обрабатывали различными концентрациями CC-I в течение 24 часов для определения экспрессии белка. После лизирования клеток в буфере RIPA (Sigma-Aldrich, Сент-Луис, Миссури, США) концентрацию белка определяли с использованием набора для анализа белков Pierce BCA (Pierce, Rockford, IL, USA). Белки разделяли электрофорезом, переносили на PVDF-мембрану и зондировали следующими первичными антителами: pan-Akt (# 4691), фосфо-Akt (p-Akt) (Ser473) (# 4060), SAPK / JNK (# 9252). ), p-SAPK / JNK (Thr183 / Tyr185) (# 4668), c-Jun (# 9165), pc-Jun (Ser73) (# 3270), HSP27 (# 2402), p-HSP27 (Ser78) (# 2405) (все от Cell Signaling, Danvers, MA, USA) и β-актина (A5441, Sigma-Aldrich). Антитела к JNK и p-JNK разводили до 1: 500. Все остальные первичные антитела инкубировали при разведении 1: 1000. Первичную реакцию антител проводили при 4 ° C в течение ночи. Антимышиные или антикроличьи вторичные HRP-антитела Amersham ECL (# NA931, # NA934, GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA) использовали при разведении 1: 5000 при комнатной температуре в течение 1 часа. Белковые сигналы детектировали с помощью Western Lightning Plus ECL (PerkinElmer, Waltham, MA, USA) и системы Amersham Imager 600 (GE Healthcare). Интенсивность сигнала полос белка анализировали с помощью программного обеспечения ImageQuant TL (GE Healthcare), и интенсивность белка нормализовали до уровня β-актина. Экспрессию белка в клетках, обработанных CC-I, сравнивали с экспрессией белка в контрольных клетках, обработанных носителем. Эксперимент вестерн-блоттинга был проведен с использованием трех различных биологических образцов. Вторичные антитела против HRP Amersham ECL (# NA931, # NA934, GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA) использовали при разведении 1: 5000 при комнатной температуре в течение 1 часа. Белковые сигналы детектировали с использованием Western Lightning Plus ECL (PerkinElmer, Waltham, MA, USA) и системы Amersham Imager 600 (GE Healthcare). Интенсивность сигнала полос белка анализировали с помощью программного обеспечения ImageQuant TL (GE Healthcare), и интенсивность белка нормализовали по уровням β-актина. Экспрессию белка в клетках, обработанных CC-I, сравнивали с экспрессией белка в контрольных клетках, обработанных носителем. Эксперимент вестерн-блоттинга был проведен с использованием трех различных биологических образцов. Антимышиные или антикроличьи вторичные HRP-антитела Amersham ECL (# NA931, # NA934, GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA) использовали при разведении 1: 5000 при комнатной температуре в течение 1 часа. Белковые сигналы детектировали с использованием Western Lightning Plus ECL (PerkinElmer, Waltham, MA, USA) и системы Amersham Imager 600 (GE Healthcare). Интенсивность сигнала полос белка анализировали с помощью программного обеспечения ImageQuant TL (GE Healthcare), и интенсивность белка нормализовали по уровням β-актина. Экспрессию белка в клетках, обработанных CC-I, сравнивали с экспрессией белка в контрольных клетках, обработанных носителем. Эксперимент вестерн-блоттинга был проведен с использованием трех различных биологических образцов. Белковые сигналы детектировали с использованием Western Lightning Plus ECL (PerkinElmer, Waltham, MA, USA) и системы Amersham Imager 600 (GE Healthcare). Интенсивность сигнала полос белка анализировали с помощью программного обеспечения ImageQuant TL (GE Healthcare), и интенсивность белка нормализовали по уровням β-актина. Экспрессию белка в клетках, обработанных CC-I, сравнивали с экспрессией белка в контрольных клетках, обработанных носителем. Эксперимент вестерн-блоттинга был проведен с использованием трех различных биологических образцов. Белковые сигналы детектировали с помощью Western Lightning Plus ECL (PerkinElmer, Waltham, MA, USA) и системы Amersham Imager 600 (GE Healthcare). Интенсивность сигнала полос белка анализировали с помощью программного обеспечения ImageQuant TL (GE Healthcare), и интенсивность белка нормализовали до уровня β-актина. Экспрессию белка в клетках, обработанных CC-I, сравнивали с экспрессией белка в контрольных клетках, обработанных носителем. Эксперимент вестерн-блоттинга был проведен с использованием трех различных биологических образцов. Экспрессию белка в клетках, обработанных CC-I, сравнивали с экспрессией белка в контрольных клетках, обработанных носителем. Эксперимент вестерн-блоттинга был проведен с использованием трех различных биологических образцов. Экспрессию белка в клетках, обработанных CC-I, сравнивали с экспрессией белка в контрольных клетках, обработанных носителем. Эксперимент вестерн-блоттинга был проведен с использованием трех различных биологических образцов.

Статистический анализ . Все данные были подвергнуты статистическому анализу с использованием t- критерия Стьюдента при сравнении двух групп. Мы использовали односторонний дисперсионный анализ с последующим тестом Тьюки-Крамера для более чем двух сравнений групп, чтобы определить, являются ли различия значительными. Для сравнения данных о динамике или концентрации мы выполнили повторный двухфакторный дисперсионный анализ ANOVA с последующим тестом Тьюки-Крамера. LC 50 (50% летальная концентрация) CC-I определяли с использованием простого логистического регрессионного анализа программного обеспечения GraphPad Prism (версия 7) в качестве общего индикатора токсичности. В исследовании модели подкожной опухоли in vivo мы использовали двухфакторные модели ANOVA с последующим тестом множественного сравнения Тьюки для сравнения объема опухоли. ДляВ исследованиях in vitro и in vivo данные отображаются в виде среднего значения ± стандартная ошибка среднего (SEM). Различия между средними считались статистически значимыми, когда значение p было меньше 0,05.

Полученные результаты

Цитотоксичность CC-I в отношении клеток SH-SY5Y нейробластомы человека, экспрессирующих HFE . Ранее мы сообщали, что клетки C282Y HFE / SH-SY5Y устойчивы к лекарствам и радиации ( 20 ). Мы подтвердили наш предыдущий вывод ( 21 ) о том, что клетки, экспрессирующие C282Y HFE, пролиферировали с гораздо большей скоростью, чем клеточные линии WT HFE / SH-SY5Y, на основании подсчета количества клеток ( рисунок 1A ) и анализа пролиферации клеток MTS ( рисунок 1B ). Соединение CC-I было более цитотоксичным для резистентных к терапии и быстрорастущих клеток нейробластомы человека C282Y HFE / SH-SY5Y по сравнению с чувствительными к терапии клетками HFE / SH-SY5Y дикого типа ( фиг. 1C ). LC 50 CC-I на клетках WT HFE / SH-SY5Y и C282Y HFE / SH-S5Y составляло 3,1 ± 0,3 мкМ и 1,8 ± 0,3 мкМ, соответственно.

Влияние C282Y HFE и CC-I на выживаемость клеток нейробластомы. (AB). Влияние C282Y HFE на пролиферацию клеток. A. Клетки высевали с плотностью 10000 клеток на лунку в 24-луночные планшеты, а затем подсчитывали количество живых клеток после окрашивания 0,2% трипановым синим на 2, 5 и 8 дни (n = 3). #p <0,001 — по сравнению с WT HFE / SH-SY5Y. B. Клетки высевали с плотностью 4000 клеток на лунку в 96-луночные планшеты, а затем измеряли рост клеток с помощью анализа пролиферации клеток MTS в течение десяти дней (n = 3). Данные отображаются как среднее ± SEM. Некоторые из полос погрешностей на графике меньше, чем обозначенный на рисунке символ. #p <0,001 — по сравнению с WT HFE / SH-SY5Y. C. Цитотоксичность CC-I для клеток SH-SY5Y, стабильно трансфицированных мутантом HFE дикого типа (WT) или C282Y. Ночные культивированные клетки (2 × 10 4клеток / лунку для клеток WT HFE / SH-SY5Y и 8 × 10 3 клеток / лунку для клеток C282Y HFE / SH-SY5Y из-за разной скорости пролиферации клеток) обрабатывали в течение 48 часов, а затем проводили анализ цитотоксичности МТТ. Данные отображаются как среднее ± SEM (n = 3). * p <0,05 — по сравнению с контролем с носителем. D. Цитотоксичность CC-I для устойчивых к лекарствам клеток нейробластомы человека (SK-N-AS, CHLA-171) и нормальных дермальных фибробластов человека (nHDF). Клетки (4 × 10 3 клеток / лунку) культивировали в течение ночи и подвергали воздействию различных концентраций CC-I в течение 72 часов, а затем проводили анализ МТТ. Эксперименты проводили в трех экземплярах и повторяли не менее трех раз. Данные отображаются как среднее ± SEM (n = 3). ** p <0,01 между nHDF и SK-N-AS.

Цитотоксичность CC-I для клеток нейробластомы и фибробластов человека . CC-I также был цитотоксичен для других устойчивых к лекарствам клеток нейробластомы, таких как SK-N-AS и CHLA-171, в зависимости от дозы, но был относительно менее токсичен для нормальных дермальных фибробластов человека (nHDF) ( рис. 1D). ). LC 50 CC-I на клетках фибробластов составляла 9,3 ± 3,9 мкМ, тогда как для клеток SK-N-AS и CHLA-171 LC 50 CC-I составляла 3,1 ± 0,9 мкМ и 2,1 ± 0,1 мкМ, соответственно.

Гибель клеток (поздний апоптоз / некротический или ранний апоптоз) и анализ клеточного цикла в клетках нейробластомы человека, обработанных CC-I . Соединение CC-I индуцировало более высокую скорость поздней апоптозной / некротической гибели клеток, чем ранняя апоптотическая гибель клеток, дозозависимым образом в клетках C282Y HFE / SH-SY5Y . Более того, обработанные CC-I клетки C282Y HFE / SH-SY5Y показали значительное снижение фазы G0 / G1 и увеличение фаз S и G 2 / M по сравнению с необработанными клетками

CC-I (10 мкМ) индуцировал более высокий уровень позднего апоптоза (верхняя правая область) по сравнению с ранним апоптозом (нижняя правая область) или некрозом (верхняя левая область) через 3 часа обработки клеток SK-N-AS . Через 24 часа лечения CC-I индуцировал как поздний апоптоз, так и некроз, что почти в 6 раз выше по сравнению с контролем (14,3% против 2,3% для позднего апоптоза; 3,0% против 0,5% для некроза).

ротивоопухолевый эффект CC-I на модели подкожной мышиной нейробластомы человека . Чтобы оценить противоопухолевый эффект CC-I на модели опухоли нейробластомы in vivo , мы использовали модели опухолей мышей, которым подкожно вводили C282Y HFE / SH-SY5Y и SK-N-AS. Еженедельные внутрибрюшинные инъекции CC-I полностью подавляли рост опухоли у мышей SCID по сравнению с контрольными мышами, которым вводили инъекции носителя ( p < 0,001). На основании уровней печеночных и почечных ферментов в сыворотке не наблюдалось токсичности ни для печени, ни для почек . Однако CC-I не показал противоопухолевого действия на модели подкожной опухоли у мышей SK-N-AS по сравнению с контрольными мышами, получавшими носитель.

 

Экспрессия HSP27-Akt-JNK в клетках нейробластомы человека, обработанных CC-I . Экспрессию нескольких белков, участвующих в передаче сигнала, определяли путем измерения уровней фосфорилирования белков. Мы исследовали, влияет ли CC-I на экспрессию Akt и p-Akt в клетках C282Y HFE / SH-SY5Y, поскольку экспрессия p-Akt была увеличена в глиобластоме человека, обработанной CC-I (неопубликованное наблюдение), и в клетках рака легких ( 12 ). как было показано в матрице человеческой фосфокиназы на раннем этапе лечения. Кроме того, Akt является важным белком, участвующим в гибели клеток ( 22 ), а активация передачи сигналов фосфоинозитид-3-киназы (PI3K) / Akt является плохим прогностическим индикатором нейробластомы ( 23).). Хотя экспрессия p-Akt не увеличивалась после 24-часового воздействия CC-I на клетки C282Y HFE / SH-SY5Y (36 мкМ) по сравнению с контрольной группой носителя, экспрессия Akt снижалась . Отношение уровней экспрессии фосфорилированных Akt к уровням Akt увеличивалось в три раза на 16 мкМ CC-I после 24-часового воздействия . CC-I значительно увеличивал экспрессию двух изоформ p-JNK (Thr183 / Tyr185) (46, 54 кДа) . Уровни фосфорилированного c-Jun также были повышены в клетках, обработанных CC-I, по сравнению с контрольными клетками; однако уровни c-Jun также были увеличены CC-I. Увеличение уровней фосфорилированной формы HSP27 (Ser78) также наблюдалось в обработанных CC-I клетках C282Y HFE / SH-SY5Y

Выводы:

Мы продемонстрировали цитотоксичность, апоптоз / некроз, остановку клеточного цикла и противоопухолевый эффект соединения CC-I на нейробластомы. Механизмы гибели клеток, активируемые CC-I, могут быть опосредованы активацией HSP27-Akt-JNK ( т.е. повышенной экспрессией фосфорилированной формы белков).

Мы обнаружили, что экспрессия p-JNK ( т.е. активация JNK) была значительно увеличена в клетках нейробластомы, обработанных CC-I. Это открытие согласуется с нашими предыдущими результатами, показывающими активацию JNK в клетках рака легких, обработанных CC-I ( 12 ). JNK играют критическую роль в путях передачи сигналов стресса и во многих клеточных функциях, таких как пролиферация, дифференцировка, клеточное старение и гибель клеток ( 24 , 25 ). Несколько соединений показали противоопухолевый эффект путем активации JNK в раковых заболеваний , таких как рак яичников и рак легких ( 26 — 28). Активация JNK может быть про- или антиапоптотической в ​​зависимости от нижестоящих сигнальных факторов, которые активируются, и / или продолжительности активации JNK ( 29 ). Кроме того, длительная активация JNK связана с апоптозом, тогда как острая и временная активация JNK участвует в пролиферации клеток ( 30 , 31 ). Более того, известно, что JNK играют центральную роль как в апоптозе, опосредованном рецептором смерти, так и в апоптозе, опосредованном митохондриями. В настоящем исследовании мы продемонстрировали активацию Akt-JNK в нейробластомах, обработанных CC-I. Это согласуется с современными знаниями о том, что путь передачи сигналов JNK является одним из нижестоящих путей передачи сигналов PI3K / Akt ( 32 ).

Более того, мы обнаружили повышенную экспрессию p-HSP27, но пониженную экспрессию HSP27 в нейробластомах, обработанных CC-I. HSP27 — это небольшой белок теплового шока, который выполняет несколько функций. Экспрессия HSP27 была увеличена в тканях рака легких и сыворотке пациентов с раком легких ( 33 ). Пациенты с раком легких с повышенным уровнем HSP27 были связаны с плохо дифференцированным раком ( 33 ). Таким образом, наш настоящий результат подтверждает, что гибель клеток нейробластомы, вызванная CC-I, связана со снижением HSP27 и повышением уровней p-HSP27. Более того, HSP27 может напрямую связываться с Akt и увеличивать его фосфорилирование ( 34 ), а также ингибировать апоптоз путем прямого взаимодействия и активации Akt ( 35). В совокупности эти наблюдения предполагают, что механизм вызванной CC-I гибели клеток в восприимчивых клетках нейробластомы осуществляется через активацию пути HSP27-Akt-JNK. Хотя C282Y HFE может индуцировать как ответ развернутого белка, так и реакцию перегрузки эндоплазматического ретикулума в клеточных линиях эмбриональной почки человека HEK293 ( 36 ), неизвестно, существует ли связь между C282Y HFE и путем HSP27-Akt-JNK.

В клетках нейробластомы CC-I индуцировал более позднюю апоптотическую / некротическую гибель клеток, чем раннюю апоптотическую гибель клеток. Это резко контрастировало с данными для клеток астроцитомы, обработанных той же концентрацией CC-I, где он индуцировал больше апоптоза, чем некроза ( 10 ). Это различие можно объяснить различиями в клеточных линиях и механизмах рака. Однако как в астроцитомах, так и в нейробластомах CC-I индуцировал остановку клеточного цикла в фазах S и G2 / M ( 10 ). Некоторые противоопухолевые агенты, включая яды топоизомеразы II ( например , доксорубицин, этопозид), вызывают задержку S и G 2 / M в раковых клетках ( 37 , 38). Эти результаты предполагают, что CC-I может проявлять токсичность, ингибируя топоизомеразу нейробластом, как мы наблюдали в астроцитомах ( 10 ).

В моделях опухоли нейробластомы in vivo у мышей, получавших CC-I, не было признаков токсичности для печени или почек. Этот результат согласуется с нашими предыдущими данными о токсичности крови у мышей, получавших CC-I с внутричерепным ксенотрансплантатом ( 10 ). Несмотря на то, что CC-I продемонстрировал устойчивый противоопухолевый эффект на модели подкожной мыши C282Y HFE / SH-SY5Y, он не оказал противоопухолевого эффекта в модели рака SK-N-AS. CC-I был эффективен в модели культуры клеток для обеих этих клеточных линий, хотя клетки SH-SY5Y были более чувствительными. Таким образом, расхождение в исследовании in vivo может отражать эту разницу. Существуют также генетические фоновые различия между линиями мышей (линия SCID № 236 vs.. бестимусная голая линия мышей № 490). В то время как иммунодефицитная бестимусная бестимусная мышь, которую мы использовали для модели опухоли SK-N-AS, имеет дефицит только Т-клеток, мышь SCID, используемая для клеток C282Y HFE / SH-SY5Y in vivo, является моделью опухоли как Т-клеток, так и В-клеток. дефицитный. Мы использовали два разных штамма мышей, потому что клетки C282Y HFE / SH-SY5Y не образуют подкожных опухолей у бестимусных мышей линии nude № 490, но образуют опухоли у мышей SCID линии № 236. Другой потенциальной причиной может быть разница в скорости роста опухоли двух клеточных линий (C282Y HFE / SH-SY5Y vs. SK-N-AS) в подкожно имплантированных моделях опухолей мышей. Развитие опухоли у мышей, которым инъецировали клетки C282Y / SH-SY5Y, показало гораздо более медленную скорость роста, чем у мышей, которым инъецировали клетки SK-N-AS. Таким образом, CC-I оказывал противоопухолевое действие на медленно растущие опухоли. Следовательно, различия in vivo могут быть связаны с быстрым ростом подкожных опухолей SK-N-AS и сниженной чувствительностью к CC-I, что указывает на то, что для наблюдения противоопухолевых свойств может потребоваться более высокая доза или увеличенная частота дозирования CC-I. эффект.

В исследовании цитотоксичности in vitro CC-I показал более сильное цитотоксическое действие на клетки C282Y HFE / SH-SY5Y по сравнению с клетками WT HFE / SH-SY5Y. Клетки C282Y HFE / SH-SY5Y растут быстрее, чем клетки WT HFE / SH-SY5Y. Это говорит о том, что клетки C282Y HFE / SH-SY5Y имеют более короткое время удвоения и больше характеристик рака по сравнению с клетками WT HFE / SH-SY5Y. Таким образом, CC-I более эффективен в клетках C282Y HFE / SH-SY5Y по сравнению с клетками WT HFE / SH-SY5Y, как и большинство других противораковых агентов / лекарств, нацеленных на быстрорастущие клетки. Ларссон и др. сообщили, что обработка соединением имеет решающее значение в течение первых 24 часов, потому что существует аналогичная LC 50 между разными популяциями клеток с разным временем удвоения по сравнению с более длительным временем воздействия, например, 48 часов ( 39). Эти результаты позволяют предположить, что существует другая мишень или механизм гибели клеток для CC-I в клетках C282Y HFE / SH-SY5Y. Эффективность CC-I в отношении других типов раковых клеток, экспрессирующих C282Y HFE на разных уровнях и с разным планом введения CC-I, должна быть дополнительно изучена в будущем с использованием различных фоновых линий мышей для оценки специфичности CC-I.

Настоящие и предыдущие результаты ( 21 ) показывают, что C282Y HFE влияет на характеристики нейробластомы, такие как устойчивость к терапии и пролиферация клеток. В нескольких исследованиях сообщалось, что однонуклеотидные полиморфизмы (SNP) в генах [например, член С 1 подсемейства АТФ-связывающей кассеты (ABCC1); каспаза 8 (CASP8); Эксцизионная репарация 1 ERCC, некаталитическая субъединица эндонуклеаз / эксцизионная репарация 4 ERCC, некаталитическая субъединица эндонуклеаз (ERCC1 / XPF или ERCC1 / ERCC4); поли (АДФ-рибоза) полимераза 1 (PARP1); базовая эксцизионная пластика (BER); метилтрансфераза как 14 (METTL14)] являются факторами риска для развития нейробластомы и выживаемости пациентов ( 40 — 45). Наши данные показывают, что частота SNP C282Y HFE у пациентов с нейробластомой также должна быть определена в будущих клинических исследованиях.

Настоящее исследование имеет несколько ограничений. Во-первых, мы определили опосредованную CC-I апоптотическую / некротическую гибель клеток путем окрашивания ДНК-связывающим красителем иодидом пропидия и флуоресцентно-меченным аннексином V с использованием проточной цитометрии в единой временной точке. Он не включает другие параметры, такие как морфологические, биохимические и молекулярные события. Во-вторых, мы не изучали, приводит ли измененные уровни HSP27-Akt-JNK с помощью siRNA или ингибиторов к CC-I-опосредованной гибели клеток. Дальнейшие исследования должны быть сосредоточены на глубоком понимании механизма действия CC-I.

В заключение мы продемонстрировали противоопухолевый эффект CC-I на нейробластомы, стабильно экспрессирующие C282Y HFE, с использованием культуры клеток in vitro и моделей опухолей мышей in vivo . Цитотоксичность CC-I опосредована поздним апоптозом / некрозом, остановкой клеточного цикла в фазах S и G2 / M и активацией пути HSP27-Akt-JNK. Настоящие результаты предполагают, что CC-I может быть эффективным средством лечения нейробластом, экспрессирующих C282Y HFE, или медленно развивающихся опухолей за счет активации HSP27-Akt-JNK.

ссылки

  1. Matthay KKMaris JMSchleiermacher GNakagawara AMackall CLDiller L and  Weiss WANeuroblastomaNat Rev Dis Primers 2160782016. PMID: 27830764. DOI: 10.1038/nrdp.2016.78(https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/27830764/)
  2. Cohn SL, Pearson AD, London WB, Monclair T, Ambros PF, Brodeur GM, Faldum A, Hero B, Iehara T, Machin D, Mosseri V, Simon T, Garaventa A, Castel V, Matthay KK and INRG Task Force: The International neuroblastoma risk group (INRG) classification system: an INRG
    task force report. J Clin Oncol 27(2): 289-297, 2009. (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/19047291/)
  3. Sokol E and Desai AV: The evolution of risk classification for Neuroblastoma. Children
    (Basel) 6(2): 27, 2019. (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/19047291/)
  4. Tolbert VP and Matthay KK: Neuroblastoma: clinical and biological approach to risk stratification and treatment. Cell Tissue Res 372(2): 195-209, 2018.(https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/19047291/)
  5. Nguyen R and Thiele CJ: Immunotherapy approaches targeting neuroblastoma. Curr Opin Pediatr 33(1): 19-25, 2021. (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/30262852/)
  6. Sholler GLS, Ferguson W, Bergendahl G, Bond JP, Neville K, Eslin D, Brown V, Roberts W, Wada RK, Oesterheld J, Mitchell D, Foley J, Parikh NS, Eshun F, Zage P, Rawwas J,Sencer S, Pankiewicz D, Quinn M, Rich M, Junewick J and Kraveka JM: Maintenance DFMO increases survival in high risk Neuroblastoma. Sci Rep 8(1): 14445, 2018.(https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/30262852/)
  7. Cole KA and Maris JM: New strategies in refractory and recurrent neuroblastoma:translational opportunities to impact patient outcome. Clin Cancer Res 18(9): 2423-2428, 2012.  (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/22427348/)
  8. Lee SY, Slagle-Webb B, Rizk E, Patel A, Miller PA, Sung SS and Connor JR: Characterization of a novel anti-cancer compound for astrocytomas. PLoS One 9(9):e108166, 2014. (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/25255031/)
  9. Ramisetti SR, Pandey MK, Lee SY, Karelia D, Narayan S, Amin S and Sharma AK: Design and synthesis of novel thiobarbituric acid derivatives targeting both wild-type and BRAF-mutated melanoma cells. Eur J Med Chem 143: 1919-1930, 2018. (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/29133035/)
  10. Lee SY, Slagle-Webb B, Sharma AK and Connor JR: Characterization of a novel barbituric acid and two thiobarbituric acid compounds for lung cancer treatment. Anticancer Res 40(11): 6039-6049, 2020. (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/33109542/)
  11. Goldschneider D, Horvilleur E, Plassa LF, Guillaud-Bataille M, Million K, Wittmer- Dupret E, Danglot G, de Thé H, Bénard J, May E and Douc-Rasy S: Expression of C-terminal deleted p53 isoforms in neuroblastoma. Nucleic Acids Res 34(19): 5603-5612,2006. (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/17028100/)
  12. Keshelava N, Zuo JJ, Chen P, Waidyaratne SN, Luna MC, Gomer CJ, Triche TJ and Reynolds CP: Loss of p53 function confers high-level multidrug resistance in neuroblastoma cell lines. Cancer Res 61(16): 6185-6193, 2001. (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/11507071/)
  13. Lee SY, Patton SM, Henderson RJ and Connor JR: Consequences of expressing mutants of  the hemochromatosis gene (HFE) into a human neuronal cell line lacking endogenous HFE. FASEB J 21(2): 564-576, 2007. (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/17194693/)
  14. Saito Y, Nishio K, Ogawa Y, Kimata J, Kinumi T, Yoshida Y, Noguchi N and Niki E: Turning point in apoptosis/necrosis induced by hydrogen peroxide. Free Radic Res 40(6):619-630, 2006.(https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/16753840/)
  15. Ali MA, Kandasamy AD, Fan X and Schulz R: Hydrogen peroxide-induced necrotic cell death in cardiomyocytes is independent of matrix metalloproteinase-2. Toxicol In Vitro 27(6):1686-1692, 2013. P(https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/23665313/)
  16. Richards KN, Zweidler-McKay PA, Van Roy N, Speleman F, Trevino J, Zage PE and Hughes DP: Signaling of ERBB receptor tyrosine kinases promotes neuroblastoma growth in vitro and in vivo. Cancer 116(13): 3233-3243, 2010. (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/20564646/)
  17. Li C, Yang C and Wei G: Vandetanib inhibits cisplatin resistant neuroblastoma tumor growth and invasion. Oncol Rep 39(4): 1757-1764, 2018. (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/29436676/)
  18. Lee SY, Liu S, Mitchell RM, Slagle-Webb B, Hong YS, Sheehan JM and Connor JR: HFE polymorphisms influence the response to chemotherapeutic agents via induction of p16INK4A. Int J Cancer 129(9): 2104-2114, 2011. (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/21190189/)
  19. Ali-Rahmani F, Hengst JA, Connor JR and Schengrund CL: Effect of HFE variants on sphingolipid expression by SH-SY5Y human neuroblastoma cells. Neurochem Res 36(9): 1687-1696, 2011.(https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/21243428/)
  20. Song M, Bode AM, Dong Z and Lee MH: AKT as a therapeutic target for cancer. Cancer Res
    79(6): 1019-1031, 2019. (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/30808672/)
  21. Opel D, Poremba C, Simon T, Debatin KM and Fulda S: Activation of Akt predicts poor
    outcome in neuroblastoma. Cancer Res 67(2): 735-745, 2007.(https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/17234785/)
  22. Yarza R, Vela S, Solas M and Ramirez MJ: c-Jun N-terminal Kinase (JNK) signaling as a therapeutic target for alzheimer’s disease. Front Pharmacol 6: 321, 2016.(https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/26793112/)
  23. Dhanasekaran DN and Reddy EP: JNK signaling in apoptosis. Oncogene 27(48): 6245-6251,2008. (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/18931691/)
  24. Huang HL, Chao MW, Li YC, Chang LH, Chen CH, Chen MC, Cheng CC, Liou JP, Teng CM and Pan SL: MPT0G066, a novel anti-mitotic drug, induces JNK-independent mitotic arrest, JNK-mediated apoptosis, and potentiates antineoplastic effect of cisplatin in ovarian cancer. Sci Rep 6: 31664, 2016. (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/27526962/)
  25. Han J, Lv W, Sheng H, Wang Y, Cao L, Huang S, Zhu L and Hu J: Ecliptasaponin A induces apoptosis through the activation of ASK1/JNK pathway and autophagy in human lung cancer cells. Ann Transl Med 7(20): 539, 2019. (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/31807521/)
  26. Fan J, Ren D, Wang J, Liu X, Zhang H, Wu M and Yang G: Bruceine D induces lung cancer cell apoptosis and autophagy via the ROS/MAPK signaling pathway in vitro and in vivo. Cell Death Dis 11(2): 126, 2020. (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/32071301/)
  27. Liu J and Lin A: Role of JNK activation in apoptosis: a double-edged sword. Cell Res 15(1): 36-42, 2005. (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/15686625/)
  28. Sánchez-Perez I, Murguía JR and Perona R: Cisplatin induces a persistent activation of JNK that is related to cell death. Oncogene 16(4): 533-540, 1998. (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/9484843/)
  29. Chen YR and Tan TH: The c-Jun N-terminal kinase pathway and apoptotic signaling (review). Int J Oncol 16(4): 651-662, 2000. (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/10717232/)
  30. Zhao HF, Wang J and Tony To SS: The phosphatidylinositol 3-kinase/Akt and c-Jun N-terminal kinase signaling in cancer: Alliance or contradiction? (Review). Int J Oncol47(2): 429-436, 2015. (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/26082006/)
  31. Sheng B, Qi C, Liu B, Lin Y, Fu T and Zeng Q: Increased HSP27 correlates with malignant biological behavior of non-small cell lung cancer and predicts patient’s survival. SciRep 7(1): 13807, 2017. (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/29062135/)
  32. Liu Z, Liu Y, Long Y, Liu B and Wang X: Role of HSP27 in the multidrug sensitivity and resistance of colon cancer cells. Oncol Lett 19(3): 2021-2027, 2020. (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/32194698/)
  33. ↵Rane MJ, Pan Y, Singh S, Powell DW, Wu R, Cummins T, Chen Q, McLeish KR and Klein JB:Heat shock protein 27 controls apoptosis by regulating Akt activation. J Biol Chem 278 (30): 27828-27835, 2003. (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/12740362/)
  34. Lawless MW, Mankan AK, White M, O’Dwyer MJ and Norris S: Expression of hereditary hemochromatosis C282Y HFE protein in HEK293 cells activates specific endoplasmic reticulum stress responses. BMC Cell Biol 8: 30, 2007. (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/17650303/)
  35. Wang H, Ao M, Wu J and Yu L: TNFα and Fas/FasL pathways are involved in 9-methoxycamptothecin-induced apoptosis in cancer cells with oxidative stress and G2/M cell cycle arrest. Food Chem Toxicol 55: 396-410, 2013. PMID: Wang H, Ao M, Wu J and Yu L: TNFα and Fas/FasL pathways are involved in 9-methoxycamptothecin-induced apoptosis in cancer cells with oxidative stress and G2/Mcell cycle arrest. Food Chem Toxicol 55: 396-410, 2013.(https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/23369935/)
  36. Kolb RH, Greer PM, Cao PT, Cowan KH and Yan Y: ERK1/2 signaling plays an important role in topoisomerase II poison-induced G2/M checkpoint activation. PLoS One 7(11):e50281, 2012. (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/23166842/)
  37. Larsson P, Engqvist H, Biermann J, Werner Rönnerman E, Forssell-Aronsson E, Kovács A, Karlsson P, Helou K and Parris TZ: Optimization of cell viability assays to improve replicability and reproducibility of cancer drug sensitivity screens. Sci Rep 10(1): 5798, 2020. (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/32242081/)
  38. Pajic M, Murray J, Marshall GM, Cole SP, Norris MD and Haber M: ABCC1 G2012T single nucleotide polymorphism is associated with patient outcome in primary neuroblastoma and altered stability of the ABCC1 gene transcript. Pharmacogenet Genomics 21(5): 270-279, 2011. (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/21317832/)
  39. Rihani A, De Wilde B, Zeka F, Laureys G, Francotte N, Tonini GP, Coco S, Versteeg R, Noguera R, Schulte JH, Eggert A, Stallings RL, Speleman F, Vandesompele J and Van Maerken T: CASP8 SNP D302H (rs1045485) is associated with worse survival in MYCN-amplified neuroblastoma patients. PLoS One 9(12): e114696, 2014. (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/25502557/)
  40. Zhuo ZJ, Liu W, Zhang J, Zhu J, Zhang R, Tang J, Yang T, Zou Y, He J and Xia H: Functional Polymorphisms at ERCC1/XPF Genes Confer Neuroblastoma Risk in Chinese Children. EBioMedicine 30: 113-119, 2018. (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/29544698/)
  41. Avitabile M, Lasorsa VA, Cantalupo S, Cardinale A, Cimmino F, Montella A, Capasso D, Haupt R, Amoroso L, Garaventa A, Quattrone A, Corrias MV, Iolascon A and Capasso M: Association of PARP1 polymorphisms with response to chemotherapy in patients with high-risk neuroblastoma. J Cell Mol Med 24(7): 4072-4081, 2020. (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/32103589/)
  42. Zhuo Z, Zhou C, Fang Y, Zhu J, Lu H, Zhou H, Wu H, Wang Y and He J: Correlation between the genetic variants of base excision repair (BER) pathway genes and neuroblastoma susceptibility in eastern chinese children. Cancer Commun (Lond) 40(11): 641-646, 2020. (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/32780923/)
  43. Zhuo Z, Lu H, Zhu J, Hua RX, Li Y, Yang Z, Zhang J, Cheng J, Zhou H, Li S, Li L, Xia H and He J: METTL14 gene polymorphisms confer neuroblastoma susceptibility: An eight-center case-control study. Mol Ther Nucleic Acids 22: 17-26, 2020. (https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/32891980/)
Ссылка на основную публикацию
Adblock
detector