Снижение регуляции P4HA1 подавляет инвазивность глиомы, способствуя поляризации микроглии M1

Авторы Wang Q , Zhang J , Fang S, Wang J, Han X, Liu F, Jin G

Поступило 31 декабря 2020 г.

Принята к публикации 16 февраля 2021 г.

Опубликовано 8 марта 2021 г. Том 2021: 14 страниц 1771—1782

DOI https://doi.org/10.2147/OTT.S299977

Обзор анонимного коллегиального обзора

Комментарии рецензента 2

Редактор, одобривший публикацию: д-р Уильям Чо.

Циянь Ван, * Цзюньвэнь Чжан, * Шэн Фанг, Цзялинь Ван, Сянмин Хан, Фушэн Лю,

Центр исследования опухолей головного мозга Гуйшань Цзинь , Пекинский нейрохирургический институт, Пекинская лаборатория биомедицинских материалов, Пекинская больница Тяньтань, филиал Столичного медицинского университета, Пекин, 10070, Китайская Народная Республика

 

Центр исследования опухолей головного мозга Фушэн Лю , Пекинский нейрохирургический институт, Пекинская лаборатория биомедицинских материалов, Пекинская больница Тяньтань, входящая в состав Столичного медицинского университета, № 119 Нансихуансилу, район Фэнтай, Пекин, 100070, Китайская Народная Республика
Тел. + 86-10-59975626
Электронная почта guishanjin7@163.com; liufusheng@ccmu.edu.cn

Предпосылки: Поляризация клеток микроглии в микросреде глиомы тесно связана со злокачественным прогрессированием и инвазией глиом. Субъединица пролил-4-гидроксилазы α 1 (P4HA1) является ограничивающей скорость субъединицей пролил-4-гидроксилазы (P4H). В предыдущих исследованиях мы показали, что P4HA1 может способствовать пролиферации, миграции и инвазии клеток глиомы, но конкретные механизмы, посредством которых это происходит, полностью не выяснены.
Материалы и методы:Взаимодействия между клетками глиомы и микроглии были проанализированы с помощью биоинформатики. Затем для получения кондиционированной среды использовали модели совместного культивирования. Для характеристики поляризации клеток микроглии мы использовали ПЦР и иммунофлуоресценцию. Анализы пролиферации и инвазии были использованы для изучения биологического поведения клеток глиомы, пораженных микроглией. Наконец, экспрессия маркера была обнаружена с помощью иммуногистохимии в образцах мультиформной глиобластомы (GBM).
Полученные результаты:Нокдаун P4HA1 приводит к снижению хемотаксиса микроглии по отношению к клеткам GBM и увеличению поляризации микроглии в направлении фенотипа M1. Измененное состояние поляризации микроглии, в свою очередь, ингибировало пролиферацию и инвазию клеток GBM. Более того, в образцах ткани GBM уровень экспрессии P4HA1 отрицательно коррелирует с уровнем экспрессии M1-специфического маркера микроглии CD86.
Заключение: наши результаты показывают, что P4HA1 способствует формированию иммуносупрессивного микроокружения за счет перекрестного взаимодействия между GBM и клетками микроглии и косвенно увеличивает агрессивность GBM.

Ключевые слова: глиома, микроглия, P4HA1, поляризация, инвазивность.

Вступление

Множественная глиобластома (ГБМ) — самая распространенная первичная опухоль головного мозга у взрослых, на которую ежегодно приходится около 1% новых случаев рака во всем мире. 1 Среднее время общей выживаемости пациентов с ГБМ составляет менее 15 месяцев, даже при самых агрессивных методах лечения, разработанных и используемых в последние десятилетия. 2 , 3 На сегодняшний день не существует эффективной схемы лечения пациентов с ГБМ. В последние годы был достигнут обнадеживающий прогресс в лечении других опухолей на основе иммунотерапии. Это, в сочетании с более глубоким пониманием сложного взаимодействия между клетками глиомы и иммунной системой, означает, что стратегии иммунотерапии, направленные на опухолевые макрофаги (ТАМ) в микросреде глиомы, стали горячей точкой исследований. 4

ТАМ — основная проникающая популяция иммунных клеток в глиомах. ТАМ состоят из врожденных макрофагов центральной нервной системы (ЦНС), а именно клеток микроглии и макрофагов, происходящих из костного мозга. Как единственный резидентный макрофаг в головном мозге, микроглия выполняет функции иммунного надзора и поддерживает гомеостаз ЦНС. 5 , 6 В физиологических условиях микроглия обычно принимает профиль экспрессии M0-типа. Однако микроглия / макрофаги поляризованы по фенотипам активации при патологических условиях. В таких условиях микроглия / макрофаги примерно разделяются на два фенотипа: классически активированный провоспалительный фенотип M1 и альтернативно активированный противовоспалительный фенотип M2. 7 , 8Когда возникает воспаление, клетки микроглии активируются интерфероном (IFN) или липополисахаридом (LPS). Это вызывает поляризацию M1 микроглии с высокой экспрессией CD16, CD32, TNF-α, MCP-1, CD86, CD64, CD80 и других поверхностных маркеров, обычно проявляющих противовоспалительную и противоопухолевую активность. 8 , 9 Во время туморогенеза клетки глиомы секретируют растворимые факторы, включая MCP-1 (CCL2), SDF-1 (CXCL12), M-CSF (CSF-1), GM-CSF и EGF, и рекрутируют клетки микроглии и трансформируют их в фенотип M2. Микроглия M2-типа может секретировать TGF-β, ST1, EGF, IL-6 и IL-1β, чтобы способствовать росту и инвазии глиомы, а также экспрессировать некоторые поверхностные маркеры на высоких уровнях, включая CD163, CD206, CD45, CD11b и CD23. 9–14Более того, микроглия типа M2 доминирует в микроокружении глиомы, продуцируя растворимые факторы для индукции иммуносупрессии в дополнение к межклеточной контактной коммуникации и способствуя пролиферации и метастазированию злокачественной глиомы. Напротив, микроглия M1-типа, по-видимому, в воспалительном состоянии действует наоборот. 9 , 14 ТАМ считаются ключевым фактором локальной иммуносупрессии глиомы, прогрессирования опухоли и устойчивости к стратегиям иммуномодулирующего лечения. 11 , 15

Субъединица пролил-4-гидроксилазы α1 (P4HA1) является ограничивающей скорость субъединицей пролил-4-гидроксилазы (P4H). P4H — важный фермент для гидроксилирования проколлагена, синтеза и секреции коллагена. 16 P4HA1 может способствовать злокачественному прогрессированию рака груди, простаты и поджелудочной железы, но механизм остается неясным. 17–19 Ранее мы обнаружили, что P4HA1 способствует инвазивному росту глиом. 20Мы использовали набор данных The Cancer Genome Atlas (TCGA) для исследования профилей экспрессии гена P4HA1 и обнаружили, что экспрессия P4HA1 достоверно положительно коррелировала с патологической степенью глиом и была явно связана с поляризацией ТАМ. Чтобы выяснить, способствует ли P4HA1 инвазивности глиомы путем изменения состояния поляризации микроглии в микроокружении опухоли, мы совместно культивировали клетки глиомы и клетки микроглии in vitro, а затем измерили экспрессию P4HA1, M1-специфических и M2-специфических фенотипических маркеров в хирургически удаленных образцы глиомы in vivo, пытаясь выяснить роль P4HA1 в перекрестном взаимодействии между клетками GBM и поляризацией клеток микроглии.

Материалы и методы

Материалы

Клеточные линии глиомы U251 и U87 были получены из Центра клеточных ресурсов Пекинского медицинского колледжа (Национальная инфраструктура ресурсов клеточных линий, NSTI). Эти клеточные линии были подтверждены профилями коротких тандемных повторов (STR). Клеточная линия микроглии человека HMC-3 была приобретена в Американской коллекции типовых культур (АТСС, США). Нокдаун P4HA1 (sh-P4HA1) и пустой вектор (sh-Ctrl) клетки U251 и U87 были созданы в нашей лаборатории. Реагент для выделения тотальной РНК TRIzol был приобретен в Invitrogen, США. Набор для обратной транскрипции кДНК был приобретен у Promega, США. Смесь PowerUp ™ SYBR ™ Green Master Mix была приобретена в Applied Biosystems (ABI, США). Кроличьи антитела против человеческого P4HA1 (12 658-1-AP), кроличьи антитела против человеческого CD86 (13 395-1-AP) и мышиные антитела против человеческого CD206 (60 143-1-Ig) были приобретены в ProteinTech, Китай.® 488 Conjugate) и антитела против мышиного IgG (H + L) (Alexa Fluor ® 594 Conjugate) были приобретены у Cell Signaling Technology (CST, США). Козья анти-кроличья и козья антимышиная пероксидаза (HRP) были закуплены у Neobioscience, Китай. Набор для подсчета клеток-8 (CCK-8) был приобретен в Додзиндо, Япония. Количественный ПЦР-анализ в реальном времени выполняли с использованием системы ПЦР в реальном времени QuantStudio ™ 5 (ABI, США).

Культура клеток и приготовление кондиционированной среды

Клетки U251, U87 и HMC-3 культивировали в среде Игла, модифицированной Дульбекко (DMEM, Gibco, США) с добавлением 10% фетальной телячьей сыворотки (FBS, Ever Green, Китай) и 50 Ед / мл раствора пенициллин-стрептомицина (Gibco, США) при 37 ° C в увлажненном инкубаторе клеток с 5% CO 2 (Thermo, Германия).

Кондиционированную среду для совместного культивирования собирали путем совместного культивирования клеток GBM и микроглии в 6-луночных планшетах Transwell (диаметр пор 0,4 мкм). Кондиционированную среду также получали только из клеток глиомы, без совместного культивирования с клетками микроглии. Более подробно, при совместном культивировании с клетками микроглии, U251 (контроль), U251 с отключенным P4HA1 (sh-P4HA1) и U251 с пустым вектором (sh-Ctrl) были засеяны в верхние камеры Transwell с плотностью 2 × 10 4 / мл / лунку. Нижние камеры засевали клетками HMC-3 плотностью 10 5/ 2 мл / лунка. Покоящиеся клетки HMC-3 использовали в качестве контрольной группы без клеток глиомы в верхних камерах. Для получения кондиционированной среды только для клеток глиомы количество посеянных клеток глиомы в каждой группе и время культивирования оставались такими же, но нижние камеры всех групп не содержали клеток HMC-3. После 72 часов культивирования среду собирали из каждой группы и фильтровали с использованием фильтра 0,2 мкм. Все группы U87 лечились одинаково.

Иммуногистохимия и иммунофлуоресценция

После фиксации 10% формальдегидом в течение 48 часов образцы глиомы заливали парафином. Срезы опухолевых тканей были толщиной 4 мкм, и депарафинизация, извлечение антигена и блокирование неспецифического связывания были выполнены с использованием стандартных процедур. Кроличьи первичные антитела против человеческого P4HA1 (1: 200), кроличьи против человеческого CD86 (1: 200) и мышиные против человеческого CD206 (1: 400) добавляли и инкубировали в течение ночи при 4 ° C. На следующий день проводили окрашивание 3,3 Di-диаминобензидином (DAB) и контрастное окрашивание гематоксилином, и слайды обезвоживали и герметизировали нейтральной смолой. Срезы исследовали при 200-кратном увеличении, и репрезентативные изображения были получены из четырех случайно выбранных полей среза, смежного с полем, идентифицированным гематоксилином и эозином (HE). Результаты окрашивания количественно оценивали с использованием изображения J.

Иммунофлуоресцентное окрашивание маркеров поляризации микроглии было сгруппировано, как указано выше. В системах совместного культивирования Transwell круглые предметные стекла диаметром 14 мм помещали в нижние камеры перед посевом клеток микроглии. После совместного культивирования предметные стекла вынимали, промывали предварительно нагретым фосфатно-солевым буфером (PBS) и фиксировали в 4% параформальдегиде в течение 20 минут. Затем предметные стекла блокировали 5% бычьим сывороточным альбумином в течение 1 часа при комнатной температуре. Кроличьи первичные антитела против CD86 человека (1: 400) и мышиные против CD206 человека (1: 400) добавляли и инкубировали при 4 ° C в течение ночи. Срезы трижды промывали PBS, а затем инкубировали с флуоресцентным вторичным антителом, разведенным в соотношении 1: 2000, в течение 1 часа при комнатной температуре. Наконец, после трех промывок PBS плюс Tween 20 предметные стекла герметизировали, используя средство для защиты от выцветания с 4ʹ, 6-диамидино-2-фенилиндолом (DAPI).

Анализы пролиферации клеток

U251 и U87 клеток , растущих в экспоненциальной фазе были переварены и подсчитывали, затем суспендируют с кондиционированной средой в 96-луночные планшеты при плотности 5 × 10 3 /100 мкл / лунку и культивировали при 37 ° С с 5% CO 2 . Через 48 часов супернатанты отбрасывали и добавляли 100 мкл реагента CCK-8, разведенного до 1:10 в DMEM. Реакционную смесь инкубировали в течение 120 минут и определяли оптическую плотность (OD) при 450 нм с использованием считывающего устройства для микропланшетов. Для каждой группы было выполнено четыре дубликата, и каждый тест повторялся не менее трех раз.

Анализ клеточного хемотаксиса

Экспоненциально растущие клетки переваривали, подсчитывали и засевали. Вкратце, клетки НМС-3 ресуспендировали с бессывороточной DMEM и высевали в верхних камерах системы Transwell при плотности 2 × 10 4 /200 мкл / лунку, в то время как U251 (контроль), U251 с P4HA1 нокдауне (ш -P4HA1) и U251 с пустым вектором (sh-Ctrl) ресуспендировали в DMEM с добавлением 10% FBS и высевали в нижние камеры с плотностью 6 × 10 4./ 600 мкл / лунка. Бесклеточную группу (пустую) использовали для исключения влияния сыворотки. После инкубации в инкубаторе клеток в течение 16 часов клетки на верхней поверхности мембраны протирали ватными тампонами. Мигрировавшие клетки фиксировали в 4% параформальдегиде в течение 15 минут при комнатной температуре, а затем окрашивали 3% (мас. / Об.) Кристаллическим фиолетовым в течение 20 минут. В каждой группе было по три дубликата. Четыре случайных поля прикрепленных клеток в каждой лунке были сфотографированы и подсчитаны с помощью программного обеспечения ImageJ. Все группы U87 лечились одинаково.

Анализ клеточной инвазии

Анализы Transwell использовали для определения влияния поляризации микроглии на способность к инвазии глиомных клеток. Верхние камеры Transwell были покрыты Matrigel с соотношением разбавления 1: 6 в DMEM. Клетки U251 и U87 культивировали в кондиционированной среде для совместного культивирования в течение 48 часов. После переваривания и подсчета, клетки ресуспендировали в бессывороточной DMEM и высевают в верхние камеры при плотности 5 × 10 4 /200 мкл / лунку. В нижние камеры добавляли DMEM, содержащую 10% FBS. В каждой группе было по три дубликата. После инкубации в инкубаторе для клеток в течение 24 часов клетки окрашивали и подсчитывали таким же образом, как и анализы хемотаксиса.

Выделение общей РНК и анализы qRT-PCR

Тотальную РНК выделяли с использованием реагента TRIzol и обратно транскрибировали для получения кДНК. ПЦР с обратной транскрипцией (ОТ-ПЦР) выполняли в стандартном режиме, ген домашнего хозяйства GAPDH использовали в качестве внутреннего контроля, а алгоритм -ΔΔCt использовали для относительной количественной оценки. В каждой группе было по четыре дубликата, и каждый тест повторялся не менее трех раз. Используемые праймеры были синтезированы компанией Beijing Tianyihuiyuan Biotechnology Co. Ltd., и их последовательности описаны в таблице 1 .

Таблица 1 Праймеры для кПЦР, использованные в эксперименте

Биоинформатический анализ

Профили экспрессии генов глиомы разной степени патологии были загружены из базы данных TCGA ( https://portal.gdc.cancer.gov/ ). Массив GBM был разделен на группы с высокой и низкой экспрессией на основе уровней экспрессии P4HA1, и CIBERSORTx ( https://cibersortx.stanford.edu/ ) был использован для анализа относительной численности популяции иммунных клеток, инфильтрирующих опухоль. 21 год

Статистический анализ

Для статистического анализа использовалось программное обеспечение GraphPad Prism 8. Различия между группами анализировали с использованием t- критерия, однофакторного дисперсионного анализа или двустороннего дисперсионного анализа. Значение P ≤ 0,05 считалось статистически значимым.

Полученные результаты

P4HA1 сильно экспрессируется в HGG и отрицательно коррелирует с поляризацией M1 ТАМ

Уровни экспрессии мРНК P4HA1 оценивали в глиомах различной степени классификации ВОЗ с использованием данных профиля экспрессии генов из базы данных TCGA. Уровень P4HA1 был значительно повышен в глиомах высокой степени злокачественности (HGG) (ВОЗ III и ВОЗ IV) по сравнению с глиомами низкой степени злокачественности (HGG) (ВОЗ I и ВОЗ II) ( P <0,0001, рис. 1A ). Чтобы определить взаимосвязь между экспрессией P4HA1 и поляризацией ТАМ в HGG, особенно в GBM, была использована методология CIBERSORTx для определения относительной численности M1- или M2-поляризованных ТАМ в GBM. Профили матрицы RNA-seq, распределенные по квартилям для групп с высокой и низкой экспрессией P4HA1 ( рис. 1B ), были загружены в CIBERSORTx для сравнительной количественной оценки степени инфильтрации иммунных клеток ( рис. 1C и D).).  Инфильтрация ТАМ M1 в группе с низкой экспрессией P4HA1 была значительно выше, чем в группе с высокой экспрессией P4HA1. Это предполагает, что уровни экспрессии P4HA1 отрицательно коррелируют с поляризацией M1 ТАМ в GBM ( P <0,001). Однако экспрессия P4HA1 статистически не коррелировала с поляризацией M2 ТАМ ( P > 0,05).

Рис. 1 P4HA1 высоко экспрессируется в глиомах высокой степени злокачественности, а уровень его экспрессии в мультиформной глиобластоме (GBM) отрицательно коррелирует с поляризацией M1 ТАМ. ( A ) Уровни экспрессии P4HA1 в глиомах низкой степени злокачественности (LGG) и глиомах высокой степени злокачественности (HGG) были проанализированы с использованием базы данных TCGA. **** P <0,0001 ( B ) Массив GBM в базе данных TCGA был разделен на квартили на основе уровней экспрессии P4HA1, и были выбраны группы с более низким и высоким уровнем экспрессии (низкий, n = 39; высокий, n = 39 ) для последующего анализа. ( C , D ) Методология CIBERSORTx была использована для анализа относительной распространенности поляризации M1 ТАМ ( C , *** P<0,001) и поляризация M2 ( D , нс, P > 0,05) в двух вышеуказанных группах.

Нокдаун P4HA1 ослабляет хемотаксис микроглии в отношении клеток GBM

Затем мы попытались изучить, влияет ли экспрессия P4HA1 на хемотаксис микроглии по отношению к клеткам GBM, используя анализ миграции Transwell. Вкратце, камеры Transwell были разделены на четыре группы. Все четыре группы были засеяны клетками микроглии HMC-3 в верхних камерах, в то время как нижние камеры были засеяны клетками GBM. Одновременно была установлена ​​пустая группа, не содержащая ячеек. После 17 часов культивирования клетки HMC-3, которые прошли через мембраны, были окрашены и подсчитаны ( рис. 2А ). Не было статистически значимой разницы между группой с пустым вектором и контрольной группой ни в клетках U251, ни в клетках U87 ( P <0,05). Сравнение этих двух групп с пустой контрольной группой выявило очевидное увеличение миграции клеток HMC-3 ( P<0,0001 для обоих) ( Рисунок 2B ). Нокдаун P4HA1 отчетливо уменьшал миграцию клеток HMC-3 (по сравнению с контролем и sh-Ctrl, оба P <0,0001) и имел тенденцию восстанавливать число миграции до низкого уровня, аналогичного таковому в пустой группе ( P > 0,05). Эти результаты показывают, что клетки GBM обладают хемотаксисом на микроглии и что сам вектор не нарушает этот хемотаксис. Примечательно, что подавление P4HA1 может препятствовать хемотаксису микроглии по отношению к клеткам GBM и восстанавливать его до незатронутых уровней (по сравнению с холостым, P > 0,05).

Рисунок 2 Нокдаун P4HA1 снижает эффект рекрутирования клеток GBM на клетки микроглии. ( A ) Анализы Transwell использовали для обнаружения и наблюдения хемотаксического эффекта клеток U251 и U87 на клетки микроглии HMC-3. Шкала 10 мкм. ( B ) Мигрировавшие клетки подсчитывали и анализировали статистически. Нокдаун P4HA1 как в клетках U87, так и в U251 приводил к значительному снижению хемотаксиса клеток микроглии. Хеш-метки представляют собой пробел; нс # , P > 0,05; #### P <0,0001. **** P <0,0001.

Нокдаун P4HA1 в GBM способствует поляризации микроглии M1

Чтобы проверить, влияют ли уровни экспрессии GBM P4HA1 на состояние поляризации клеток микроглии, мы совместно культивировали клетки U251 и U87 GBM с клетками микроглии HMC-3 в 6-луночном планшете Transwell. Через 72 часа для обнаружения маркеров поляризации микроглии использовали анализ транскриптома и иммунофлуоресцентное окрашивание ( рис. 3А ). Результаты показали, что уровни мРНК маркеров фенотипа TNF-α и IFN-γ M1 в контрольной группе и группе sh-Ctrl существенно не отличались от таковых в пустой группе ( P > 0,05) и были значительно увеличены в sh-P4HA1. группа ( P <0,0001).

Рис.3 P4HA1 нокдаун способствовал микроглии поляризации в направлении M1 , но не влияет на М2 поляризации. ( A ) Схема микроглии HMC-3, совместно культивируемой с клеткой GBM. ( B ) ОТ-ПЦР использовали для определения уровней мРНК связанных с поляризацией маркеров в клетках HMC-3 после совместного культивирования с клетками U251 или U87. Хеш-метки представляют собой пробел; нс # , P > 0,05; #### P <0,0001. нс, P > 0,05. ( C, D ) Иммунофлуоресцентное окрашивание использовали для наблюдения экспрессии связанных с поляризацией маркеров в клетках HMC-3 после совместного культивирования с U251 ( C ) или U87 ( D) клетки. После нокдауна P4HA1 экспрессия связанного с CD86 M1 поверхностного маркера была очевидной (зеленый), а экспрессия связанного с CD206 M2 поверхностного маркера существенно не изменилась (красный). Масштабная линейка 20 мкм.

Уровни мРНК поверхностных маркеров CD206 и CD163 M2-типа не различались между группами Control, sh-Ctrl и sh-P4HA1, но были значительно увеличены в трех группах по сравнению с пустой группой ( P <0,0001, рис. 3B ). . Эти результаты согласуются с результатами, наблюдаемыми при иммунофлуоресцентном окрашивании ( рис. 3C и D).), который показал, что поверхностный маркер CD86 M1 наблюдался только в группе sh-P4HA1, в то время как поверхностный маркер CD206 M2 был экспрессирован во всех группах, кроме пустой группы. Эти результаты предполагают, что клетки GBM склонны поддерживать клетки микроглии в M2-специфическом фенотипе. Хотя нокдаун P4HA1 не изменял профиль экспрессии микроглии, связанный с M2, он индуцировал активацию маркеров, связанных с M1, включая CD86, TNF-a и IFN-γ. Вместе эти данные указывают на то, что P4HA1 участвует в сигнальных путях, которые функционируют, чтобы регулировать связанный с M1 фенотип микроглии.

Поляризация микроглии M1 ингибирует пролиферацию и инвазивность GBM

Чтобы определить, влияет ли состояние поляризации микроглии на пролиферацию клеток GBM, мы собрали кондиционированную среду каждой группы и соответственно применили их к клеткам U251 и U87 во время экспоненциального роста. Затем мы использовали анализы CCK-8 для оценки пролиферации клеток U251 и U87. Кондиционированная среда, полученная из группы sh-P4HA1, в которой клетки GBM с отключенным P4HA1 совместно культивировались с клетками HMC-3, значительно ингибировала пролиферативную активность клеток GBM U251 и U87 по сравнению с контрольными группами, включая клетки GBM, кондиционированные среда (GCM) и кондиционированная среда для совместного культивирования с HMC-3 (GMCM). Этот ингибирующий эффект был более очевиден в клетках U87 GBM ( рис. 4A ).

Рис.4. Кондиционированная среда для совместного культивирования, созданная путем культивирования клеток микроглии и клеток GBM с нокдауном P4HA1, оказывает ингибирующее действие на пролиферативные и инвазивные способности клеток GBM. ( A ) Анализы пролиферации клеток CCK-8 проводили для обнаружения активности пролиферации клеток. Кондиционированная среда для совместного культивирования из группы sh-P4HA1 показала более высокий ингибирующий эффект на активность пролиферации клеток U251 или U87, чем из других групп. Хеш-метки представляют группу совместного культивирования sh-P4HA1 по сравнению со всеми другими группами, # P <0,05; ## P <0,01; ### P <0,001; #### P <0,0001; другие группы сравнивали попарно, за исключением группы совместного культивирования sh-P4HA1, P > 0,05 (нс). (B , C ) Анализы инвазии Transwell были выполнены для определения способности клеточной инвазии. Панель B показывает результаты окрашивания кристаллическим фиолетовым. Шкала 5 мкм. Панель C показала результаты подсчета и статистической обработки мигрировавших клеток. Группа совместного культивирования sh-P4HA1 по сравнению со всеми другими группами, **** P <0,0001; другие группы сравнивали попарно, за исключением группы совместного культивирования sh-P4HA1, P > 0,05 (нс). GMCM, кондиционированная среда от совместного культивирования клеток GBM и клеток микроглии; GCM, кондиционированная среда только для клеток глиомы.

Анализы Transwell были использованы для изучения влияния кондиционированной среды на инвазивность клеток GBM ( рис. 4B ). Среда, кондиционированная группой sh-P4HA1, в которой клетки GBM совместно культивировали с клетками микроглии HMC-3, проявляла более существенный ингибирующий эффект на инвазивную способность клеток GBM, чем другие группы, включая GCM и GMCM. Ингибирующий эффект был последовательным в клеточных линиях U251 и U87 GBM ( P <0,0001) ( рис. 4C ).

Учитывая приведенные выше данные, мы предполагаем, что клетки GBM с низкими уровнями P4HA1 индуцируют поляризацию микроглии в сторону фенотипа M1 посредством взаимодействия с клетками микроглии, тем самым играя ингибирующую роль в росте и инвазии опухоли.

Экспрессия P4HA1 отрицательно коррелирует с экспрессией маркера CD86 M1 в образцах тканей GBM

Иммуногистохимическое окрашивание использовалось для определения уровней экспрессии P4HA1, CD86 и CD206 в десяти образцах ткани GBM человека ( рис. 5A ). Программное обеспечение Image-Pro Plus 6.0 использовалось для разделения результатов окрашивания на группы с низким и высоким уровнем на основе средних значений IOD белка P4HA1. Группа с низкой экспрессией P4HA1 показала отчетливо более высокие уровни CD86 ( P <0,0001), но не наблюдали разницы в CD206 ( P > 0,05) ( фиг. 5B ). Дополнительный корреляционный анализ подтвердил, что экспрессия P4HA1 отрицательно коррелировала с CD86 в клетках микроглии ( P <0,001) ( рис. 5C ).

Рис. 5 Уровень экспрессии P4HA1 отрицательно коррелирует с маркером CD86 M1 в образцах ткани GBM, но не коррелирует с маркером CD206 M2. ( A ) Результаты гематоксилина и эозина и иммуногистохимического окрашивания. Масштабная линейка, 50 мкм. ( B ) В группе с низкой экспрессией P4HA1 экспрессия маркера CD86 M1 была значительно выше, чем в группе с высокой экспрессией P4HA1, в то время как уровень экспрессии маркера CD206 M2 не отличался между двумя группами. нс, P  > 0,05; **** P <0,0001. ( C ) Был проведен корреляционный анализ между P4HA1 и CD86. Экспрессия CD86 значительно отрицательно коррелирует с экспрессией P4HA1, P <0,001, r = -0,8917.

Обсуждение

Стандартные методы лечения пациентов с ГБМ включают хирургическую резекцию, лучевую терапию (ЛТ) и химиотерапию темозоломидом. Низкую эффективность терапии можно отнести к очень агрессивной модели роста GBM. Даже при полном радикальном удалении опухоли не всегда удается полностью удалить. Более того, GBM сохраняет высокий уровень гетерогенности между различными GBM и внутри отдельных масс GBM. В результате сигнальные пути, участвующие в устойчивости к лекарствам и химиолучевой терапии при ГБМ, чрезвычайно сложны. Кроме того, GBM имеет сложную микросреду опухоли (TME). Недавние экспериментальные и клинические исследования показали, что TME играет жизненно важную роль в стимулировании туморогенеза и устойчивости к лекарствам при ГБМ. Нацеленность на иммуносупрессивный TME дает новые идеи и подходы к лечению GBM.

1. Брей Ф., Ферли Дж., Сурджоматарам И. и др. Глобальная статистика рака 2018: оценки GLOBOCAN заболеваемости и смертности во всем мире от 36 видов рака в 185 странах. CA Cancer J Clin . 2018; 68 (6): 394–424. DOI: 10.3322 / caac.21492

2. Ступп Р., Мейсон В.П., ван ден Бент М.Дж. и др. Лучевая терапия плюс сопутствующий и адъювантный темозоломид при глиобластоме. N Engl J Med . 2005. 352 (10): 987–996. DOI: 10.1056 / NEJMoa043330

3. Вэнь П.Я., Рирдон Д.А. Нейроонкология в 2015 году: прогресс в диагностике, классификации и лечении глиом. Nat Rev Neurol . 2016; 12 (2): 69–70. DOI: 10.1038 / nrneurol.2015.242

4. Пун С.К., Саркар С., Йонг В.В., Келли Дж.Дж. Микроглия и макрофаги, ассоциированные с глиобластомой: мишени для терапии, улучшающей прогноз. Мозг . 2017; 140 (6): 1548–1560. DOI: 10.1093 / мозг / aww355

5. Fu R, Shen Q, Xu P, Luo JJ, Tang Y. Фагоцитоз микроглии при заболеваниях центральной нервной системы. Mol Neurobiol . 2014. 49 (3): 1422–1434. DOI: 10.1007 / s12035-013-8620-6

6. Кеттенманн Х., Кирхгоф Ф., Верхратский А. Микроглия: новые роли синаптического стриппера. Нейрон . 2013; 77 (1): 10–18. DOI: 10.1016 / j.neuron.2012.12.023

7. Мантовани А., Соццани С., Локати М., Аллавена П., Сика А. Поляризация макрофагов: ассоциированные с опухолью макрофаги как парадигма поляризованных мононуклеарных фагоцитов M2. Trends Immunol . 2002. 23 (11): 549–555. DOI: 10.1016 / S1471-4906 (02) 02302-5

8. Мартинес Ф.О., Гордон С. Парадигма активации макрофагов M1 и M2: время для переоценки. F1000Prime Rep . 2014; 6:13. DOI: 10.12703 / P6-13

9. Амбарцумян Д., Гутманн Д.Х., Кеттенманн Х. Роль микроглии и макрофагов в поддержании и прогрессировании глиомы. Nat Neurosci . 2016; 19 (1): 20–27. DOI: 10.1038 / nn.4185

10. Комохара Й., Охниши К., Курацу Дж., Такея М. Возможное участие фенотипа противовоспалительных макрофагов М2 в росте глиом человека. J Pathol . 2008. 216 (1): 15–24. DOI: 10.1002 / путь.2370

11. Прионисти И., Бюлер Л.Х., Уокер П.Р., Жоливе РБ. Использование микроглии и макрофагов для лечения глиобластомы. Front Pharmacol . 2019; 10: 506. DOI: 10.3389 / fphar.2019.00506

12. Рош С., Рапп С., Деттлинг С., Херольд-Менде С. Когда иммунные клетки становятся плохими — ассоциированные с опухолью микроглии / макрофаги в глиоме. Int J Mol Sci . 2018; 19 (2): 436. DOI: 10.3390 / ijms19020436

13. Браун Н.Ф., Картер Т.Дж., Оттавиани Д., Малхолланд П. Использование иммунной системы при глиобластоме. Br J Рак . 2018; 119 (10): 1171–1181. DOI: 10.1038 / s41416-018-0258-8

14. Инь Дж., Валин К.Л., Диксон М.Л., Ливенворт Дж. В.; Роль миелоидных клеток в иммуносупрессивном микроокружении глиом. Роль микроглии и макрофагов в гомеостазе ЦНС, аутоиммунитете и раке. J Immunol Res . 2017; 2017: 1–12. DOI: 10.1155 / 2017/5150678

15. Локарно К.В., Симонелли М., Каренца С. и др. Роль миелоидных клеток в иммуносупрессивном микроокружении глиом. Иммунобиология . 2020; 225 (1): 151853. DOI: 10.1016 / j.imbio.2019.10.002

16. Chen L, Shen YH, Wang X и др. Транскрипция человеческой пролил-4-гидроксилазы α (i) опосредуется вышестоящими стимулирующими факторами. J Biol Chem . 2006. 281 (16): 10849–10855. DOI: 10.1074 / jbc.M511237200

17. Xu R. P4HA1 — новый регулятор пути HIF-1 при раке груди. Клеточный стресс . 2019; 3 (1): 27–28. DOI: 10.15698 / cst2019.01.173

18. Chakravarthi BVSK, Pathi SS, Goswami MT, et al. Ось miR-124-пролилгидроксилазы P4HA1-MMP1 играет критическую роль в прогрессировании рака простаты. Oncotarget . 2014. 5 (16): 6654–6669. DOI: 10.18632 / oncotarget.2208

19. Цао ХР, Цао Ю., Ли В.Дж., Чжан Х.Х., Чжу З.М. Петля обратной связи P4HA1 / HIF1α управляет гликолитическими и злокачественными фенотипами рака поджелудочной железы. Biochem Biophys Res Commun . 2019; 516 (3): 606–612. DOI: 10.1016 / j.bbrc.2019.06.096

20. Zhou Y, Jin G, Mi R, et al. Нокдаун P4HA1 ингибирует неоваскуляризацию за счет нацеливания на трансдифференцировку стволовых клеток глиомы и эндотелиальных клеток и разрушения базальной мембраны сосудов. Oncotarget . 2017; 8 (22): 35877–35889. DOI: 10.18632 / oncotarget.16270

21. Ньюман AM, Стин С.Б., Лю С.Л. и др. Определение количества и экспрессии типов клеток в тканях с помощью цифровой цитометрии. Nat Biotechnol . 2019; 37 (7): 773–782. DOI: 10.1038 / s41587-019-0114-2

22. Хаддад-Товолли Р., Драгано Н.Р.В., Рамальо AFS, Веллосо Л.А. Развитие и функция гематоэнцефалического барьера в контексте метаболического контроля. Front Neurosci . 2017; 11: 224. DOI: 10.3389 / fnins.2017.00224

23. Костяновский AM, Майер LM, Андерсон RC, Брюс JN, Андерсон DE. Астроцитарная регуляция активации моноцитов / микроглии человека. J Immunol . 2008. 181 (8): 5425–5432. DOI: 10.4049 / jimmunol.181.8.5425

24. Чарльз Н.А., Холланд ЕС, Гилбертсон Р., Гласс Р., Кеттенманн Х. Микроокружение опухоли головного мозга. Глия . 2011. 59 (8): 1169–1180. DOI: 10.1002 / glia.21136

25. Wu Y, Lu Y, Chen W, Fu J, Fan R, Tucker-Kellogg G. Эксперименты in silico по развитию микросреды глиомы и противоопухолевой терапии. PLoS Comput Biol . 2012; 8 (2): e1002355. DOI: 10.1371 / journal.pcbi.1002355

26. Пинтон Л., Мазетто Э., Ветторе М. и др. Иммуносупрессивное микроокружение глиом человека зависит от накопления макрофагов, происходящих из костного мозга, в центре поражения. J Immunother Cancer . 2019; 7 (1): 58. DOI: 10.1186 / s40425-019-0536-x

27. Wu A, Wei J, Kong LY, et al. Стволовые клетки рака глиомы индуцируют иммуносупрессивные макрофаги / микроглию. Neuro Oncol . 2010. 12 (11): 1113–1125. DOI: 10.1093 / neuonc / noq082

28. Мюллер А., Бранденбург С., Турковски К., Мюллер С., Вайкоци П. Резидентная микроглия, а не периферические макрофаги, являются основным источником мононуклеарных клеток опухоли головного мозга. Int J Cancer . 2015; 137 (2): 278–288. DOI: 10.1002 / ijc.29379

29. Бисвас С.К., Мантовани А. Пластичность макрофагов и взаимодействие с субпопуляциями лимфоцитов: рак как парадигма. Nat Immunol . 2010. 11 (10): 889–896. DOI: 10.1038 / ni.1937

30. Wang Y, Lin YX, Qiao SL, et al. Полимерные наночастицы способствуют обращению макрофагов с фенотипа M2 на M1 в микроокружении опухоли. Биоматериалы . 2017; 112: 153–163. DOI: 10.1016 / j.biomaterials.2016.09.034

31. Делло Руссо К., Лиси Л., Тентори Л. и др. Использование функций микроглии для лечения глиобластомы. Curr Cancer Drug Targets . 2017; 17 (3): 267–281. DOI: 10.2174 / 1568009616666160813191240

32. Zhang M, Hutter G, Kahn SA, et al. Обработка анти-CD47 стимулирует фагоцитоз глиобластомы поляризованными макрофагами M1 и M2 и стимулирует поляризованные макрофаги M1 in vivo. PLoS One . 2016; 11 (4): e0153550. DOI: 10.1371 / journal.pone.0153550

33. Ван Н., Лян Х., Зен К. Молекулярные механизмы, влияющие на баланс поляризации макрофагов m1-m2. Фронт Иммунол . 2014; 5: 614. DOI: 10.3389 / fimmu.2014.00614

34. Саха Д., Мартуза Р.Л., Рабкин С.Д. Поляризация макрофагов способствует искоренению глиобластомы с помощью комбинированной иммуновиротерапии и блокады иммунных контрольных точек. Раковая клетка . 2017; 32 (2): 253–267.e255. DOI: 10.1016 / j.ccell.2017.07.006

Ссылка на основную публикацию
Adblock
detector